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血漿游離腫瘤HPV定量檢測

新聞來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:[2024-09-30]

 

前言


宮頸癌是一種嚴重危害女性健康的惡性腫瘤。根據國家癌癥中心統計的數據,2022年我國宮頸癌新發(fā)15萬(wàn)例,死亡5.5萬(wàn)例,發(fā)病例數和死亡例數都超過(guò)了其他婦科腫瘤的總和[1]。早期宮頸癌(≤IB2期)通常通過(guò)手術(shù)治療,2年復發(fā)風(fēng)險為8%-10%;晚期采用放化療,2年復發(fā)風(fēng)險為30%-50%。對于接受過(guò)浸潤性宮頸癌治療的女性,定期進(jìn)行常規臨床檢查,必要時(shí)進(jìn)行輔助影像學(xué)檢查,例如磁共振成像(MRI)或計算機斷層掃描(CT)。然而,目前尚無(wú)可靠的監測標志物來(lái)預測哪些患者在宮頸癌治療后更有可能復發(fā),血漿游離腫瘤HPV(HPV ctDNA或ctHPV)是一種潛在的生物標志物[2]

 

ctHPV和分子殘留病灶檢測


HPV是一種嗜上皮組織的無(wú)包膜雙鏈環(huán)狀小DNA病毒,病毒基因組約8 kb,可分為3個(gè)區域:早期基因(包含開(kāi)放閱讀框E6、E7、E1、E8、E2、E4、E5,4.5kb)、晚期基因(包含開(kāi)放閱讀框L2和L1,2.5kb),以及非編碼上游調節區(URR)又稱(chēng)為長(cháng)控制區(LCR,1kb)。HPV基因組序列存在10%以上的不同,即為不同的基因型別。目前已發(fā)現并分離鑒定出200多種HPV型別,并按其誘發(fā)癌癥的潛力,分為高危型與低危型。其中HPV16/18型占比約70%[3]


 

▲HPV病毒基因組結構和電鏡下的HPV分子[4]

 

E6和E7是與宮頸癌關(guān)聯(lián)最緊密的致癌基因。在高危型HPV(hrHPV)持續感染期間,HPV DNA通常會(huì )整合到宿主基因組中,其負調節因子E1和/或E2被破壞,導致病毒癌基因E6和E7表達失調[5]。E6和E7蛋白分別與p53和pRb結合,導致細胞中抑癌蛋白水平顯著(zhù)降低,宿主染色體不穩定,DNA的復制出現紊亂而誘發(fā)腫瘤[2]。也有研究通過(guò)Nanopore分析HPV16型的整合方式,發(fā)現有部分病毒E6/E7并未整合到基因組中,但占比很低[5]

 

分子殘留病灶(MRD)是指經(jīng)過(guò)治療后,傳統的影像學(xué)檢查或實(shí)驗室檢測方法不能發(fā)現,但通過(guò)細胞分子生物學(xué)方法在血液等液體活檢中發(fā)現的腫瘤來(lái)源分子異常,提示腫瘤細胞持續存在或臨床進(jìn)展可能。ctDNA是指主要來(lái)源于原發(fā)腫瘤、轉移灶或循環(huán)腫瘤細胞等釋放到循環(huán)系統中的腫瘤基因組片段,其攜帶腫瘤特異性遺傳或表觀(guān)遺傳變異,可實(shí)時(shí)反映體內腫瘤狀態(tài),是臨床應用最廣泛的液體活檢生物標志物之一[6]

 

ctDNA中體細胞突變的等位基因頻率(VAF)很低,即便在晚期/轉移性癌癥(III/IV期)中,平均VAF為3.67%,中位VAF僅為0.41%[7],因此需要較高的測序深度才能有效提高變異檢出的靈敏度[6]。由于HPV是絕大多數宮頸癌的病因,并且在細胞中以多個(gè)拷貝形式存在,因此也應以ctDNA的形式釋放,它是一種潛在的生物標志物[2]。ctHPV在總cfDNA中不受高野生型背景的干擾,比點(diǎn)突變更容易檢測和鑒別,且無(wú)需定制化流程。

 

 ▲宮頸癌ctHPV檢測的概覽[2]

 

ctHPV檢測在宮頸癌中的應用


PAIR-HPV前瞻性研究(NCT02554565)納入了55例根治性放化療(CRT)一線(xiàn)治療的患者,主要為II-IVA期。在CRT治療前,69%的患者成功檢測到HPV ctDNA。HPV ctDNA水平與腫瘤中HPV拷貝數(r=0.41,p<0.001),腫瘤分期(p=0.037)和淋巴結狀態(tài)(p=0.02)相關(guān)。CRT結束時(shí)和隨訪(fǎng)期間,HPV ctDNA陽(yáng)性與較低的無(wú)病生存(DFS,p=0.048)和總生存(OS,p=0.0013)相關(guān)[8]


 ▲ctHPV檢測結果提示患者預后[8]

 

BioRAID研究(NCT02428842)入組了419例患者,94例納入無(wú)進(jìn)展生存(PFS)分析。73%的患者為FIGO III/IV期,均為16/18型,其中20%手術(shù),65%放化療,15%新輔治療。研究采用HPV E7基因作為標志物。在治療前,63%的患者檢測到HPV ctDNA。HPV ctDNA陽(yáng)性與FIGO高分期(p=0.02)和主動(dòng)脈旁淋巴結受累(p= 0.01)相關(guān)。HPV ctDNA水平與腫瘤中HPV 拷貝數呈正相關(guān)(r=0.39,p<0.001)[9]

 

研究發(fā)現基線(xiàn)時(shí)的HPV ctDNA檢測結果與PFS無(wú)關(guān)(HR=1.59;p=0.19);治療后HPV ctDNA陽(yáng)性與更短的PFS相關(guān)(p<0.0001)。44例隨訪(fǎng)患者,取治療結束時(shí)(EOT)/隨訪(fǎng)過(guò)程樣本進(jìn)行監測。除一例患者以外,EOT ctHPV陰性患者在隨訪(fǎng)期間保持陰性。75%的EOT ctHPV陽(yáng)性患者的在隨訪(fǎng)期間仍為陽(yáng)性,且全部復發(fā);2例隨訪(fǎng)期間清除ctHPV的患者未復發(fā)。ctHPV檢出陽(yáng)性較臨床確診復發(fā)的中位提前時(shí)間為10個(gè)月(2~15個(gè)月)[9]

 

 ▲ctHPV檢測結果與患者PFS的關(guān)系(A、基線(xiàn)檢測,B、EOT檢測)[9]


 ▲從EOT到隨訪(fǎng)結束,ctHPV的監測結果[9]

 

瑞典的一項研究納入74例局部晚期宮頸癌患者,采用數字PCR(ddPCR)的方法分析了418個(gè)血漿樣本,中位隨訪(fǎng)時(shí)間為37個(gè)月。92.4%的治療前樣本ctHPV陽(yáng)性。血漿中持續存在的ctHPV與較差的PFS相關(guān)(P < 0.001)。早期隨訪(fǎng)時(shí)ctHPV狀態(tài)預測疾病進(jìn)展的陽(yáng)性預測值(PPV)為87.5%,陰性預測值(NPV)為89.3%。在所有(10例)完全應答后復發(fā)的患者中,ctHPV檢出陽(yáng)性較影像學(xué)診斷復發(fā)的中位提前時(shí)間為315天[10]

 

ctHPV檢測在口咽癌中的應用

 

除宮頸癌以外,頭頸部鱗癌、肛門(mén)癌、陰道癌、外陰癌等癌種均有一定比例是由HPV感染所致。近年來(lái),歐美國家口咽癌的發(fā)病率明顯上升,研究提示大部分與HPV感染具有直接關(guān)系。我國同樣有逐年升高的趨勢。基于一項針對HPV16檢測的meta分析,國內頭頸部腫瘤的HPV16總體感染率為24.7%,口咽癌的比例為31.6%。近期一項基于WHO數據庫的研究顯示,中國HPV陽(yáng)性口咽癌的比例為25.8%[11]

 

美國Naveris公司主導的研究(NCT02281955、NCT03077243、NCT0316182)分析了45例患者的509份血液樣本,中位隨訪(fǎng)時(shí)間為19.2個(gè)月。37例患者在治療后所有時(shí)間點(diǎn)均未檢測到ctHPV,無(wú)患者復發(fā),NPV為100%。8例患者在治療后監測期間出現ctHPV陽(yáng)性,其中4例被活檢證實(shí)復發(fā)。這4例患者連續2次ctHPV陽(yáng)性,PPV為100%。ctHPV陽(yáng)性與活檢證實(shí)復發(fā)之間的中位提前時(shí)間為6.6個(gè)月(3.3-12.9個(gè)月)[12]


 ▲連續2次ctHPV監測異常的患者復發(fā)風(fēng)險更高[12]


 ▲ctHPV監測有助于早期發(fā)現疾病復發(fā)[12]

 

日本的一項研究在35例接受放療聯(lián)合或不聯(lián)合化療的HPV16相關(guān)頭頸部鱗癌患者中使ddPCR定量檢測ctHPV16 DNA。中位隨訪(fǎng)21個(gè)月后,ctHPV16 DNA和PET-CT的NPV相似(89.7% vs 84.0%),而ctHPV16 DNA的PPV遠高于PET-CT(100% vs 50.0%)[13]。CSCO頭頸部腫瘤診療指南也在注釋中提到“對于HPV相關(guān)的口咽癌,近期有研究顯示治療后定期進(jìn)行外周血HPV DNA的拷貝數(檢測)有助于早期發(fā)現腫瘤復發(fā)”[11]。相信這一監測方案不久之后會(huì )被寫(xiě)入指南。

 

ctHPV的檢測方法和注意事項

 

早期的ctHPV研究都有一個(gè)共同點(diǎn),即靈敏度相當差,大多數僅為6.9%~30%。原因可能是多方面的。熒光定量PCR(qPCR)的方法不夠靈敏,無(wú)法檢測微量的ctHPV。血漿樣本的采樣量、保存、處理方法對檢測結果亦有影響[2]。2016年,Jeannot等人發(fā)表了第一項使用ddPCR檢測血漿中ctHPV DNA的研究。在47例HPV16/18陽(yáng)性的宮頸癌患者中,他們使用ddPCR(16/18 E7)在83%的病例的治療前血漿中發(fā)現了ctHPV DNA,而使用qPCR時(shí),這一比例僅為60%(p=0.02)[14]

 

靶向HPV的高通量測序(HPV-seq)也是可選的方法之一。研究發(fā)現HPV-seq(靶向HPV和鱗癌中12個(gè)高頻突變基因)在細胞系數據中重現了小于0.6拷貝水平的檢測限。HPV-seq與ddPCR結果具有高度一致性(r2=0.95,p=1.9×10-29)。HPV-seq可以檢測出ddPCR檢測陰性的、治療后低至0.03拷貝/mL血漿中的ctDNA。治療結束時(shí)HPV ctDNA陽(yáng)性與較差的PFS相關(guān),檢測復發(fā)的敏感性為100%,特異性為67%(ddPCR法均為75%)[15]

 

前瞻性、多中心驗證研究(NCT03853915、NCT03702309)納入了70接受CRT治療的IB-IVA期宮頸癌患者。分別在基線(xiàn)時(shí)、CRT結束時(shí)、CRT后4~6周和CRT后3個(gè)月采集患者的外周血,同時(shí)使用ddPCR和HPV-seq兩種方法檢測ctHPV水平。主要終點(diǎn)為2年的PFS率,中位隨訪(fǎng)時(shí)間為2.2年,70例HPV陽(yáng)性宮頸癌患者中有24例PFS事件。HPV-seq顯示出與ddPCR相似的結果。與ctHPV陰性的患者相比,在CRT結束時(shí)、CRT后4~6周和CRT后3個(gè)月,ctHPV陽(yáng)性的患者2年的PFS顯著(zhù)更差。無(wú)論采用ddPCR還是HPV-seq,與影像學(xué)相比,發(fā)現復發(fā)的中位提前時(shí)間為5.9個(gè)月[16]

 

 

▲這兩種檢測方法一致顯示:ctHPV快速清除的患者,具有更好的PFS,其次是逐漸清除的患者;而ctHPV升高的患者,PFS顯著(zhù)更差[16]

 

 

需要注意的是,ctHPV定量檢測不適用于健康女性或癌前病變患者的篩查。9項采用qPCR法的研究和最近幾項基于ddPCR法的研究均未在癌前病變患者血漿中檢出ctHPV;唯一檢出的研究中,血漿中的HPV狀態(tài)與宮頸樣本的相關(guān)性相當差(44%)。大多數在健康女性中使用qPCR或ddPCR檢測ctHPV的檢出率僅為0%至2%。ctHPV在早期患者中的陽(yáng)性率也較低,I~II期宮頸癌患者基線(xiàn)ctHPV陽(yáng)性率為24.1~65%;晚期(III~IV期)患者基線(xiàn)ctHPV陽(yáng)性率可達到63~100%[2]

 

總結

 

ctHPV檢測的是整合到人類(lèi)基因組,并釋放到血漿中的HPV游離DNA的E6/E7基因,用于分子殘留病灶(MRD)檢測,可以輔助預測治療效果,更可提早數月提示疾病復發(fā)。飛朔生物的人ctHPV16/18型定量檢測采用數字PCR法,靈敏度可達到1-3拷貝/反應,而且實(shí)驗操作簡(jiǎn)便,報告周期短。飛朔生物致力于為腫瘤個(gè)體化精準醫學(xué)檢測提供最具創(chuàng )新性的產(chǎn)品和服務(wù),并持續更新現有產(chǎn)品。

 

 

參考文獻

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[5] Nat Commun. 2022 May 10;13(1):2563.

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[9] Clin Cancer Res. 2021 Nov 1;27(21):5869-5877.

[10] Clin Cancer Res. 2024 Jul 1;30(13):2764-2771.

[11] CSCO頭頸部腫瘤診療指南2023

[12] J Clin Oncol. 2020 Apr 1;38(10):1050-1058.

[13] Int J Cancer. 2021 Feb 15;148(4):995-1005.

[14] J Pathol Clin Res. 2016 Jun 28;2(4):201-209.

[15] Clin Cancer Res. 2021 Nov 1;27(21):5857-5868.

[16] J Clin Oncol. 2024 Feb 1;42(4):431-440.

 

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